Познате су геномске секвенце већине вируса.Сонде нуклеинске киселине које су кратки сегменти ДНК дизајнирани да се хибридизују са комплементарним вирусним ДНК или РНК сегментима.Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је ефикаснија техника за откривање вируса.Недавно су развијене дијагностичке методе високе пропусности.
А. Техника хибридизације нуклеинске киселине
Хибридизација нуклеинске киселине, углавном укључујући Соутхерн блоттинг (Соутхерн) и Нортхерн блоттинг (Нортхерн), је нова техника која се брзо развија у пољу дијагностике вируса.Образложење теста хибридизације је коришћење кратких сегмената ДНК (званих „сонда“) дизајнираних да се хибридизују са комплементарним вирусним ДНК или РНК сегментима.Загревањем или алкалним третманом, дволанчана циљна ДНК или РНК се одвајају у једноструке ланчиће, а затим се имобилишу на чврстој подлози.Након тога, сонда се додаје и хибридизује са циљном ДНК или РНК.Пошто је сонда обележена изотопом или нерадиоактивним нуклидом, циљна ДНК или РНК се могу открити путем ауторадиографије или помоћу система биотин-авидин.Пошто је већина вирусних генома клонирана и секвенционирана, они се могу открити коришћењем секвенци специфичних за вирус као сонди у узорку.Тренутно, методе хибридизације укључују: дот блот , ин ситу хибридизацију у ћелијама , ДНК блоттинг (ДНК) (Соутхерн блот) и РНК блот (РНА) (Нортхерн блот).
Б.ПЦР технологија
Последњих година развијена је серија ин витро техника амплификације нуклеинске киселине засноване на ПЦР-у, за тестирање неосетљивих или некултивисаних вируса.ПЦР је метода која може да синтетише специфичну ДНК секвенцу реакцијом ин витро полимеразе.Процес ПЦР укључује термички циклус од три корака: денатурација, жарење и екстензија На високој температури (93℃~95℃), дволанчана ДНК се раздваја у два једнострука ДНК ланца;затим на ниској температури (37℃~60℃), два синтетизована нуклеотидна прајмера спајају комплементарне ДНК сегменте;док на одговарајућој температури за Так ензим (72℃), синтеза нових ланаца ДНК почиње од 3' краја прајмера користећи комплементарну ДНК као шаблоне и појединачне нуклеотиде као материјале.Дакле, након сваког циклуса, један ланац ДНК може бити умножен у два ланца.Понављајући овај процес, сваки ДНК ланац синтетизован у једном циклусу може да се користи као шаблон у следећем циклусу, а број ланаца ДНК се удвостручује у сваком циклусу, што значи да се производња ПЦР-а појачава брзином од 2н лог.Након 25 до 30 циклуса, производња ПЦР-а се идентификује путем електрофорезе, а специфични ДНК производи се могу посматрати под УВ светлом (254нм).Због своје предности у погледу специфичности, осетљивости и погодности, ПЦР је усвојен у клиничкој дијагнози многих вирусних инфекција као што су ХЦВ, ХИВ, ЦМВ и ХПВ.Пошто је ПЦР веома осетљив, може да открије ДНК вируса на нивоу фг, операцију треба обавити веома пажљиво како би се избегли лажни позитивни резултати.Поред тога, позитиван резултат теста нуклеинске киселине не значи да у узорку има живог инфективног вируса.
Уз широку примену ПЦР технике, развијају се нове технике и методе засноване на ПЦР техници за различите сврхе тестирања.На пример, квантитативни ПЦР у реалном времену може открити вирусно оптерећење;ин ситу ПЦР се користи за идентификацију вирусне инфекције у ткиву или ћелијама;Угнежђени ПЦР може повећати специфичност ПЦР-а.Међу њима, квантитативни ПЦР у реалном времену се брже развија.Многе нове технике, као што су ТакМан хидролизна сонда, хибридизациона сонда и молекуларна беацон сонда, комбиноване су у квантитативну ПЦР технику у реалном времену, која се широко користи у клиничким истраживањима.Осим што прецизно идентификује вирусно оптерећење у телесним течностима пацијената, овај метод се такође може користити за откривање мутанта толерантног на лекове.Стога се квантитативни ПЦР у реалном времену углавном примењује у процени куративног ефекта и надзору толеранције на лекове.
Ц. Високо пропусна детекција вирусних нуклеинских киселина
Да би се задовољиле потребе за брзом дијагностиком нових емергентних заразних болести, успостављене су различите методе детекције високе пропусности, попут ДНК чипова (ДНК).За ДНК чипове, специфичне сонде се синтетишу и везују за мале силицијумске чипове у веома високој густини да би се формирао микрониз ДНК сонде (ДНК) који се може хибридизовати са узорком.Сигнал хибридизације се може снимити конфокалним микроскопом или ласерским скенером и даље обрадити рачунаром и може се добити огроман скуп података о различитим генима.Постоје две врсте ДНК чипа.„Чип за синтезу“ је следећи: специфични олигонуклеотиди се синтетишу директно на чиповима.Други је ДНК чип.Клонирани гени или ПЦР производи су уредно одштампани на слајду.Предност технологије ДНК чипа је истовремено откривање велике количине ДНК секвенци.Најновија верзија чипа за откривање патогена може идентификовати преко 1700 људских вируса одједном.Технологија ДНК чипа решила је проблеме традиционалних метода хибридизације нуклеинских киселина и има веома широку примену у вирусној дијагностици и епидемиолошким студијама.
Време објаве: 23.12.2020